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北虫草液体菌种制作技术

北虫草液体菌种制作技术

一、培养基配方
配方:玉米粉1%、葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母粉0.5%、磷酸二氢钾0.1%、水95.35%、硫酸镁0.05%、维生素B1 10mg、PH值调至6.5左右。
二、制作培养方法
❶ 制作一级摇瓶种:将这些原料溶于水后装在500毫升三角瓶中,每个三角瓶装量200毫升,放入玻璃珠3粒左右,塞紧棉塞,然后用4层纱布罩住棉塞、瓶口扎紧,放在高压灭菌锅内进行消毒,待压力表上升至0.5kg/cm2压力时,即放净冷气待指针降至0后,再关掉放气阀门,待温度表指针逐渐上升至1.1kg/cm2后就开始保温30分钟后,慢慢下降指针至0,然后开盖冷却至常温,再移入接种箱或超净工作台等待接种。
❷ 接种方法:先把灭菌后的北虫草液体菌种培养基移放在超净工作台上,并把北虫草母种和接种勾、酒精灯、酒精棉球等接种物品也放在超净工作台上,工作服挂在接种室消毒。然后在接种室点燃烟雾剂(用臭氧消毒器更好),立即关闭所有门窗密闭消毒,同时打开紫外线灯,待40min后,将烟雾放净,关闭紫外线灯,接种人员就可进行接种。接种方法是穿好工作服,打开超净工作台风机,点燃酒精灯,左手拿着母种试管对准火焰口,右手拿着铁勾在酒精灯火焰消毒3-5秒种后立即伸进母种试管内把菌种分成5-7段,再用左手迅速将纱布瓶盖打开,右手立即把一段菌块勾入瓶内(每瓶接入5-6片0.5平方厘米大小菌种)速将瓶盖按原样盖紧。
当北虫草菌种接好后,移入22-24℃恒温培养室,摇床震荡发菌培养。摇床转速140r/min,经过4-6天的发菌培养,经检查北虫草菌液的颜色开始清亮、菌球密集,瓶口闻有很浓的北虫草气味,可判断为菌种优良。如发现发菌瓶内浓度低、气味臭,并有五颜六色的菌液,就是有杂菌污染,坚决不能用。
❸ 制作二级摇瓶:培养基同一级,用5000ml三角瓶装量2000ml北虫草液体菌种,灭菌冷却后把一级摇瓶种按10%无菌操作接入大摇瓶,22-24℃,140r/min震荡培养72小时后,菌球大小均匀、密度80%以上,菌液清亮,气味清香、无污染的即为合格菌种。由于5000ml大摇瓶体积较大,用手提高压锅放不下,用大锅又太浪费,为解决大摇瓶灭菌问题,可选用100升立式电加热自控高压灭菌锅,一次可灭4个5000的大摇瓶。
❹ 菌种稀释:发好的虫草液体菌种接种前需要稀释以扩大接种规模。稀释倍数依据接种的盘数按5-8倍稀释。用稀释罐稀释时,按液体罐空消、实消操作规程:
(A)发酵罐空消
发酵罐空消(内胆、过滤器、管线的消毒)是对发酵罐进行设备消毒灭菌的过程,对于放置一周不用的发酵罐或者是因为停电使空压机(打气泵)停止运转的发酵罐都需要进行发酵罐的空消操作,具体操作方法:
(1)关闭发酵罐,除夹套排气门外的所有阀门,拧紧发酵罐罐口盖子。
(2)启动电源,打开控制柜“灭菌”键,此时进入灭菌状态。
(3)当温度升到100℃夹套有蒸汽冒出时关闭夹套排气阀门,此时给夹套升温升压,当夹套压力达到0.05Mpa以上时,缓慢打开夹套进过滤器阀门,打开过滤器尾阀门。
(4)当过滤器冷凝水排放完毕有蒸汽冒出后微开过滤器尾阀门,缓慢打开进气阀门尾阀门,排放空气管道内的冷凝水,冷凝水排放完毕后缓慢打开进气阀门,使得蒸汽慢慢进入罐体。
(5)微开发酵罐排气气阀门,缓慢将发酵罐内的冷空气排放出去,在空消的整个过程中,控制发酵罐排气阀门,使得发酵罐排气阀门有少量蒸汽流通。
(6)当控制柜温度显示接近123℃,发酵罐罐内压力接近0.12Mpa时缓慢打开接种管道尾端,将接种管道内冷凝水排放完毕后,保证尾端有少量蒸汽冒出保证蒸汽流通。
(7)当温度达到123℃,发酵罐压力达到0.12Mpa时控制柜开始时间倒计时,屏幕上显示温度和倒计时时间,当倒计时时间为0时,控制柜自动报警,此时空消结束。
(8)空消结束后,关闭发酵罐加热棒,关闭夹套进过滤器阀门、发酵罐进气阀门、发酵罐接种阀门、接种管道尾端阀门。微开发酵罐排气阀门、夹套排气阀门、发酵罐进气阀门尾阀门、使得夹套和发酵罐的压力慢慢下降,当过滤器压力即将卸完时,打开空压机(打气泵),使得空气流通过滤器,通过过滤器的空气在发酵罐进气阀门尾阀门排放掉,流过过滤器的空气对滤芯吹30min,使得吹出的空气无水分后备用。
(B)发酵罐实消
(1)定量加入清水后,打开夹套排气阀门和发酵罐排气阀门,启动电源,按下“灭菌”键,此时进入灭菌状态。
(2)当温度升到100℃夹套有蒸汽冒出时关闭夹套排气阀门,发酵罐排气阀门微开,整个发酵罐实消过程中控制发酵罐排气阀门的开度,保证发酵罐罐内冷空气排净并保证有蒸汽流通。
(3)当控制柜显示屏幕上显示温度123℃,压力表压力0.12 Mpa时控制柜自动倒计时,屏幕上可显示发酵罐温度和倒计时时间,当时间倒计时为0时,控制柜自动报警,打开夹套排气阀门,发酵罐排气阀门,使得夹套和发酵罐压力缓慢下降(发酵罐压力不能掉零)此时发酵罐灭菌结束。
注意:计时开始时和灭菌即将结束时需要对发酵罐进行排水操作,微开接种阀门,有少量气、水排出即可,每次排水时间3-5min。排水的目的一是排出阀门处的生水;二是对阀门管路进行灭菌。
定量加入清水123℃灭菌40分钟,冷却至20度,使用空压机保持正压,无菌操作方法倒入摇瓶种,无菌空气搅拌均匀,罐内升压至0.5mpa接种(接种与液体接种操作相同),接种量50-60ml。接种后18-21℃避光培养,好的菌种7-10天封满料面。(  来源:山东淄博花山nba直播网站研究所)

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